Alain Hovnanian的进展报告

原文链接因改版失效。翻译:周迎春。初次翻译:2006年8月。最后更新:2012/12/27 。

4.1 简介

    本项目希望验证用逆转录病毒进行RDEB体外基因治疗的前临床研究的所有步骤。我们开始阶段就已经由鼠干细胞病毒[MSCV, Murine Stem Cell Virus]构造了一个包含COL7A1 cDNA的逆转录病毒载体。我们产生并提纯了高滴度的与多种包膜蛋白结合的含COL7A1的逆转录病毒悬浮液。我们随后改进了转导条件,提高培养液中基因 传递到人类RDEB原胶原细胞的效率。修正后的胶原细胞分泌出了正常分子量(290kDa)的VII型胶原蛋白。然而,把这种基因改造后的胶原细胞培养成 皮肤并移植到裸鼠身上后,基因没有在生物体内长期表达。而且,最近关于X-SCID患者基因治疗引起了白血病的报道促使我们改变了策略。这种严重的副作用 使我们考虑使用更安全的(自灭活)载体。我们已经设计了两种更安全的含COL7A1互补DNA的逆转录病毒和慢病毒自 灭活载体,本报告会详细说明。我们估计新的载体转运效率会明显降低,生产条件需要重新优化。使用安全的逆转录病毒和慢病毒,为评估基因的长期表达而进行的 对基因体外试验和等价体内试验的更改使项目需要延长。

4.2 设计和构造COL7A1基因治疗载体

    我们设计了两类载体来改造RDEB原胶原细胞,从Moloney鼠白血病病毒改造出两种逆转录病毒,从艾滋病病毒(HIV-1)改造出一种慢病毒。这些病毒的构造方法如下:

图1:COL7A1逆转录病毒和慢病毒载体的构造

A. MSCV-hCOL7 (逆转录病毒)

B. SFG-K14-hCOL7 (逆转录病毒)

C. SIN-cPPT-hPGK-hCOL7 (慢病毒)

LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复(long terminal repeat),其中含有强启动子序列。

4.2.1 逆转录病毒

    在第一个构造中(图1A),COL7A1 cDNA包含在典型的逆转录病毒中,由修改过的MoMuLV长末端重复启动子控制。 在第二个构造中(图1B),基因包含在一个自灭活逆转录病毒中,由真皮基底层中的角蛋白14启动子控制表达。

基于小鼠白血病病毒MoMuLV启动子的构造:

    从鼠类胚胎干细胞中提取鼠干细胞病毒MSCV,它的LTR比胚胎癌性细胞中MoMuLV LTR表达能力更强。MSCV-hCol7A1构造中包括完整的COL7A1 cDNA,由前病毒中的5'LTR和加帽信号y控制(图1A)。

含角蛋白14启动子的自灭活载体:

    由于天然LTR的复制能力能导致受体原癌基因的表达,我们希望通过使用SFG载体(自 灭活载体的一种)来提高COL7A1逆转录病毒的生物安全性。SFG载体是把MFG载体中的3'LTR增强子去除得到的。在这种载体里,3'LTR的关键 部位增加了删除突变,用于灭活前病毒中的5'LTR。这种使前病毒的复制能力失效的方法称为自 灭活,这种载体称为自灭活载体(SIN)。SIN方法是载体生物安全性方面的一个重大进展。灭活前病毒中LTR的复制调节部分的缺点是病毒滴度的显著降 低,比原来的逆转录病毒载体滴度低10到100倍。由于LTR启动子的失活,移植的基因必须由别的启动子控制。我们这里选择了角蛋白14(K14)启动子 来保证COL7A1 cNDA在表皮基底层角细胞中的表达。

4.2.2 慢病毒

    与简单的逆转率病毒不同,慢病毒能感染不在分裂过程中的,处于分化末端的哺乳动物细胞。慢病毒的这种特性使他们成为一种非常有吸引力的基因载体。我们构造了一个包含COL7A1 cDNA的慢病毒载体(图1C),它也是一种自灭活载体,可能比传统的逆转录病毒更安全。它包含一个内部持续启动子,人磷酸甘油酸激酶(hPGK,human phosphoglycerate kinase promoter)。另外,这种由艾滋病病毒变种的载体还包含中心多嘌呤管道(cPPT,central polypurine tract)和REV应答体,它们帮助病毒体在没有有丝分裂的时候穿越核孔。它还含有土拨鼠肝炎病毒调控因子(WPRE, Woodchuck-hepatitis-virus Post-transcriptional Regulatory Element),能增强病毒RNA的稳定性。

4.3 病毒载体的制备

    为了避免产生具有复制能力的质粒,我们用共转染技术临时制备这三种载体。病毒结构与一个编码辅助功能的质粒和一个编码包膜蛋白的质粒一起转染到293T细胞中。

4.3.1 逆转录病毒载体

    包含COL7A1 cDNA的重组基因组,和一个表达GAG和POL cDNA(分别编码衣壳蛋白和逆转录酶)的辅助质粒,和一个表达ENV cDNA(编码包膜蛋白)的质粒共转染。

4.3.2 慢病毒载体

    包含COL7A1 cDNA的重组基因组,和一个表达GAG、PRO和POL的cDNA(分别编码衣壳蛋白、蛋白酶和逆转录酶)的辅助质粒,和一个表达ENV cDNA(编码包膜蛋白)的质粒,和一个表达REV蛋白(负责经由RRE位置把成熟的病毒mRNA从细胞核输出)的质粒共转染。

    通过上述过程,表达COL7A1 cDNA的重组基因组装到了293T细胞中。48小时之后收集了包含病毒粒子的细胞上清液并且冷冻。目前在RDEB原角化细胞中只测试了含“传统”COL7A1逆转录病毒颗粒的细胞上清夜。自灭活逆转录病毒和慢病毒COL7A1构造还没有在RDEB原角化细胞中测试过。

4.4 RDEB角化细胞转导

    角化细胞的转导受多种因素的影响。我们测试了每一种因素的作用,以达到最好的转导效率。

4.4.1 包膜蛋白的选择

    我们用在MSCV LTR的控制下可以表现强效绿光蛋白的逆转录鼠干细胞病毒-强效绿光蛋白载体(MSCV-EGFP,Enhanced Green Fluroscent Protein),感染了RDEB原角化细胞。通过荧光激活细胞分选(FACS Fluorescent Activated Cell Sorter)分析感染后的细胞分布,确定了最佳的转染条件。我们测试了3种包膜蛋白:小鼠白血病病毒MoMuLV双 栖包膜蛋白(Amphotropic envelope protein),水泡性口炎病毒G蛋白VSV-G(G-protein of the Vesiculous Stomatitis Virus),和长臂猿白血病毒GALV包膜蛋白(Gibbon Amphotropic Leukemia Virus)。这三种包膜蛋白能感染多种生物的多种细胞。附着有逆转录病毒颗粒的MoMuLV双栖和GALV包膜蛋白比较脆弱,不能通过超速离心法浓缩。 VSV-G载体可以通过超速离心浓缩100-300倍。VSV-G的缺点是细胞毒性。

    双栖包膜蛋白的性能与VSV-G一样好,优于GALV包膜蛋白。由于我们得到了足够的滴度,并且VSV-G蛋白的细胞毒性可能阻碍临床试验,我们决定用“传统”的逆转录COL7A1结构附着在双栖包膜蛋白上。

4.4.2 凝聚胺浓缩,细胞滴度和感染复数(Mutliplicity Of Infection,MOI)

    凝聚胺大大提高了逆转率病毒的感染效率。这是一种微小的带正电的分子,可以附着在细胞表面中和电荷。由于减小了含硅酸的分子间的排斥,这明显加快了病毒表 面糖蛋白与受体结合的速度。不同的细胞对凝聚胺的耐受力不同,范围通常在1到10µg/ml。我们测试了从1到50的感染复数(MOI,病毒颗粒和细胞的 比例)。当凝聚胺密度为5µg/ml,角化细胞密度较低,感染复数为20时结果最佳。

4.4.3 VII型胶原的重新表达

    图2显示了两群RDEB角化细胞在基因转染前(图2A)后(图2B)的VII型胶原(褐色)荧光着色。平均有85%的RDEB角化细胞恢复正常,可以表达 VII型胶原。蛋白质印迹分析证明转染细胞产生的VII型胶原分子量(290kDa)正确,并且可以分泌到细胞培养基中(图3)。进一步的生化分析,即胶 原螺旋的稳定性和蛋白质水解耐受力,将在Leena Brückner-Tuderman's博士的实验室进行。

图2. COL7A1逆转录病毒+双栖蛋白包膜基因转染(MOI:20)前(A)后(B)RDEB角化细胞VII型胶原的表达


图3. 转染后的RDEB角化细胞和培养基中VII型胶原的蛋白质印迹分析

4.5. 基因工程RDEB皮肤在裸小鼠身上移植

    为确定矫正后的RDEB细胞是否能在体内恢复生成VII型胶原并形成锚丝纤维,我们进行了重组上皮细胞的移植试验。首先培养矫正过的细胞,直到获得足以进 行移植的上皮。两组各10只小鼠分别移植了原始RDEB细胞、矫正的RDEB细胞、或正常角化细胞。经分离酶处理以后,分离的上皮使用硅胶片移植到裸鼠的 背部皮肤。7天内,在一只移植了矫正后RDEB角化细胞的小鼠上观察到了重组的上皮组织。一个月后,提取了10微米的冷冻切片,通过荧光着色检测到了 VII型胶原。但是,在这个阶段,上皮开始大面积的坏死。正常角化细胞的移植同样不成功,表明这一移植技术还无法进行长期的移植试验。